LEGIONELLAN TESTAUSMENETELMIEN VERTAILU
Laboratorioviljely on yleisesti hyväksytty menetelmä legionellan havaitsemiseen. Useimmat maailman laboratorioista käyttävät edelleen viljelymenetelmää. Se edellyttää selektiivisiä elatusaineita ja pitkittyneitä inkubaatiojaksoja. Pitoisuusvaihetta seuraa lämmöllä ja hapolla tehtävä dekontaminaatio, mikä voi aiheuttaa kohdebakteerien menetyksen. Inkubaatiovaihe itsessään kestää 10–14 päivää, eikä se tunnista bakteerin virulenttia vaihetta, jolloin bakteeri on elinkelpoinen muttei viljeltävissä. Markkinoilla on myös muita nopeita testejä, joista useimmat perustuvat DNA:n havaitsemiseen ja joita kutsutaan PCR-testeiksi (Polymerase Chain Reaction). PCR-testit eivät toimi paikan päällä. Ne edellyttävä näytteen lähettämistä erikoislaboratorioon, jossa pitkälle kehitetyt laitteet ja hyvin koulutettu henkilökunta analysoivat, tulkitsevat ja raportoivat tulokset. Vaikka testaus on nopeaa, näytteen keräämisestä tulosten saamiseen kuluu tyypillisesti yli 24 tuntia, koska vesinäytteet kuljetetaan laboratorioon. Katso vertailutaulukkoa, jossa vertaillaan markkinoilla olevien tärkeimpien analyysimenetelmien hyötyjä ja haittoja.
ONKO NOPEUS LEGIONELLA-TESTIN TÄRKEIN OMINAISUUS?
Diagnostiikkateollisuus on jo jonkin aikaa siirtynyt laboratorio- ja viljelytestauksesta paikan päällä tapahtuvaan nopeaan testaukseen. Paikan päällä ja reaaliajassa tapahtuvan testauksen edut ovat ilmeisiä. Niihin kuuluvat tapausten parempi ja tiheämpi seuranta, välitön tieto nopeiden toimien tueksi, käyttäjän osallistuminen ja vastuu ja asiantuntija-ajan tehokkaampi käyttö. Nämä edesauttavat kohdennetumpaa, joustavampaa ja yksilöllisesti räätälöidympää käsittelyä. Ympäristöalalla ne edistävät parempaa kansanterveyttä. Yhdistyneen Kuningaskunnan legionella-alalla näin ei vielä ole. Syyn siihen tietää parhaiten Yhdistyneen Kuningaskunnan terveysviranomainen (HSE). Heidän mielestään on edelleen parempi, että tiedon saaminen vakavasta legionella-infektiosta tai korjaustoimen toimivuudesta – tai sen toimimattomuudesta – kestää 10­–14 päivää. Legionella-testauksen nopeutta arvioitaessa on huomioitava aika, joka kuluu näytteen kuljettamisessa laboratorioon. Hydrosense Legionella -testi on markkinoiden nopein testi – tulos saadaan 25 minuutissa. Sen tärkein ominaisuus on kuitenkin, että se antaa reaaliaikaisen tuloksen paikan päällä. Käsittelyä varten ei tarvita uutta käyntiä tekniseltä asiantuntijalta. Älypuhelimelle tarkoitettu Hydrosense-lukusovellus ja yhdistetty tietoportaali varmistavat, että tuloksia voidaan kommunikoida ja hallita reaaliaikaisesti.
ELÄVIEN JA KUOLLEIDEN LEGIONELLA-SOLUJEN HAVAITSEMINEN
Hydrosense-testin suurin etu on, että se on erittäin hyvä havaitsemaan legionella-antigeeniä. Se on myös erittäin spesifinen Legionella pneumophilan seroryhmälle 1 (LpSG1). Positiivinen testitulos on siis merkki ongelmasta, jonka korjaamiseksi on ryhdyttävä välittömiin toimenpiteisiin, koska kyseessä on kaikkein virulentein legionella-laji. Lisäksi testi havaitsee LpSG1:n sen virulenteimmassa vaiheessa, kun se on elinkelpoinen ja vaarallinen, mutta ei viljeltävissä. Silloin sitä ei siis voida havaita viljelymenetelmillä. Jotkut esittävät, että antigeenitestit havaitsevat sekä eläviä että kuolleita soluja. Testi havaitsee kuitenkin antigeeniä. Antigeeni itsessään ei säily hallitussa vesijärjestelmässä. Tutkimukset osoittavat, että muutaman minuutin kuluttua ei voida enää havaita hyvin alhaisiakaan kloorissa olevia legionella-antigeenipitoisuuksia, joten positiivinen tulos kertoo vakavasta ongelmasta. Lataa lisätietoja kohdasta Persistence of Legionella antigen under biocides 140213 v4.
Hydrosense Legionella -testIN VALIDOINTI
Innovatiivinen Hydrosense-menetelmä on saanut hyväksynnän sekä kaupallisilta että tieteellisiltä tutkimuslaitoksilta maailmanlaajuisesti, myös Kiinassa. Alankomaiden veden kiertokulun tutkimuslaitos KWR suoritti tutkimuksen, jossa verrattiin kolmea vesijärjestelmien legionella-kontaminaatiota analysoivaa tekniikkaa. Nopean ja luotettavan seurantajärjestelmän kehittäminen mahdollistaa saastuneiden järjestelmien nopean käsittelyn. Testatuista menetelmistä sekä q-PCR että viljelytestaus edellyttävät laboratoriota, joten niihin liittyy aikaviive, eikä niitä voida suorittaa paikan päällä. Hydrosense-testi, josta käytetään raportissa nimeä Fastpath, voidaan tehdä paikan päällä ilman koulutusta ja se antaa luotettavan tuloksen 25 minuutissa. Legionellan viljelytestit ovat riippuvaisia ​​siitä, että bakteeri on oikeassa vaiheessa elinkaartaan. Se ei aina ole havaittavissa viljelyssä, eikä sitä voida havaita sen kaikkein virulenteimmassa vaiheessa. Lisäksi viljelytestin tulokset voivat kestää jopa kaksi viikkoa. Hydrosense-testi hyödyntää raskaustesteissä yleisesti käytettyä lateraalivirtaustekniikkaa havaitsemaan Legionella pneumophila seroryhmä 1 -antigeenin vedestä. Testi voidaan tehdä suoraan vesinäytteestä, tai se voidaan yhdistää suodatukseen suurempaa herkkyyttä varten. Testi on tarkoitettu kenttäkäyttöön, edellyttää hyvin vähän käyttökoulutusta eikä se vaadi muuta erikoisvarustusta. KWR:n raportissa todetaan seuraavaa: "Testin nopeuden ja yksinkertaisuuden [tämä menetelmä] ansiosta se vaikuttaa hyödylliseltä lisätyökalulta prosessinohjaajalle, joka vastaa jäähdytysvesijärjestelmien päivittäisestä valvonnasta. Menetelmän kohdentuneisuus täydentää hyvin ATP-mittauksia, pesäkemäärämittauksia tai objektilaseja, joita jo käytetään vesijärjestelmien valvontaan. Testin nopeus ja yksinkertaisuus tekevät siitä poikkeuksellisen mielenkiintoisen hätätilanteissa tapahtuvaan seurantaan".
VEDEN LÄMPÖTILAN SÄÄTÖ JA NÄYTTEENOTTO
Monissa osissa maailmaa legionellaa torjutaan ensisijaisesti säätelemällä veden lämpötilaa. Veden lämpötilan tulee olla 20-asteista (kylmä vesi), jolloin kasvu pysähtyy, tai yli 55-asteista (kuuma vesi), jolloin bakteerit kuolevat. Veden lämpötilan ollessa 20–55-asteista, eli kun se on sekoitettu käyttölämpötilaan, legionella kasvaa nopeasti ja riskit ovat suurempia. Kylmä vesi siis säilöö bakteerin. Järjestelmä voi silloin saastua milloin tahansa, kun valvontaa vähennetään tai kylmiät ja kuumat vesivirrat sekoittuvat. 55-asteinen lämpötilakaan ei ole testauskaava vaan valvontatoimenpide. Lämpötilalla ei ole väliä näytteenoton kannalta. Vesinäytteen lämpötila laskee huomattavasti matkalla laboratorioon. Jos kuljetus tapahtuu nopeasti, bakteerikuormitus ei juurikaan vaihtele. Jos aikaa kuluu enemmän kuin muutamia tunteja, bakteerikuormitus kasvaa näytteen lämmetessä. Tämä on yksi syy siihen, että paikan päällä tehtävä testi antaa tarkemman tuloksen. Varsinainen bakteerikuormitus ei juurikaan vaihtele paikan päällä tehtävään testiin kuluvien muutaman minuutin aikana. Vesijärjestelmässä on melko vaikeaa ylläpitää jatkuvaa korkeaa lämpötilaa. Jos lämpötilaa mitattaisiin ensin lämpölähteen (kattilan läheltä), ja sitten kauempaa, siinä esiintyisi melko suuria vaihteluita. Yksi syy testien tarpeellisuuteen on, että käsittely ei vaikuta tasaisesta kaikkialla järjestelmässä. Hyvän hallinnan varmistamiseksi kylmävesijärjestelmän lämpötilan on oltava alle 20-asteista Kylmävesijärjestelmä aiheuttaa suuremman riskin, jos näin ei ole. Kun vettä sekoitetaan, lämpötila on tietenkin ihanteellisella 20–55-asteen kasvualueella. Sekoitushanat ovat pahamaineisia bakteerinlähteitä. Niihin muodostuu biofilmiä ja sen myötä bakteereita. Kasvua voidaan torjua huuhtelemalla ne kuumalla vedellä, mutta torjunnan toimivuus on varmistettava testeillä. Lopulta biofilmissä kasvaa legionellaa, jota pääsee päävesijärjestelmään aika ajoin. Tilanteen pitäisi olla hallinnassa, kun koko vesijärjestelmän lämpötila on yli 55-asteista, jolloin bakteeri kuolee. Huomaa, että tämä EI ole keski- vaan vähimmäislämpötila. Bakteerin hallinta menetetään aina kun lämpötila laskee alle 55-asteiseksi. Järjestelmä altistuu bakteerille jatkuvasti kylmän veden ja vesijohtoverkon kautta. Sitä piilee myös kuolleissa kulmissa ja vähän käytetyissä tiloissa, joissa veden lämpötilaa ei pidetä yli 55-asteisena. Tämä johtuu yksinkertaisesti siinä, että näitä osia putkistosta ei huuhdella säännöllisesti kuumalla vedellä. Paikan päällä suoritettava Hydrosense-testi voidaan tehdä korkeintaan 45-asteisesta vedestä. Kun näyte otetaan kuumasta vedestä, sen voidaan antaa jäähtyä muutamia minuutteja. Muutaman minuutin jäähdytys ei nosta bakteerikuormaa merkittävästi. Suodatusta käytettäessä lämpötila voi olla jopa 100-asteinen, koska suodatusprosessi jäähdyttää vesinäytteitä riittävästi, jotta testi voidaan suorittaa ongelmitta.
LEGIONELLA-RYHMIEN VERRANNOLLINEN VIRULENSSI
Legionella pneumophila on eukaryoottisten solujen loinen. Se on kehittynyt selviytymään ja replikoitumaan laajassa alkueläinten joukossa. Se voi myös tartuttaa ihmisen alveolaarisia makrofageja opportunistisena patogeeninä, joka aiheuttaa legionelloosia. Olennaista infektioprosessissa on, että L. pneumophila käyttää erikoistunutta erityssysteemiä siirtääkseen efektoreiksi kutsuttuja bakteeriproteiineja isäntäsoluihin. Nature Genomics -julkaisun tuore tutkimus antaa hyödyllistä tietoa mekanismista, jonka avulla legionella-lajit manipuloivat eukaryoottisia soluprosesseja liikkuakseen ja replikoituakseen isäntäsoluissa. Sillä on myös vaikutusta erilaisten lajien virulenssimekanismeihin. Katso koko raportti. 38 legionella-lajia tutkittiin vertailukelpoisilla genomisilla sekvensointimenetelmillä niiden efektoreiden monimuotoisuuden selvittämiseksi. Näin saatiin viitteitä kunkin lajin virulenssista. Tutkituista 38 lajista todettiin, että Legionella pneumophila sisälsi eniten efektoreita ja eniten lajispesifisiä efektoreita, mikä vahvistaa Lp:n aseman virulenteimpana legionella-lajina. Legionella pneumophila -seroryhmää 1 pidetäänkin yleisesti kaikkein virulenteimpana legionella-lajina. Valitettavasti tutkimuksessa ei tehty erottelua Legionella pneumophilan eri seroryhmien välillä, joten niiden verrannollista virulenssista ei saatu lisätietoa. Tällainen tutkimus olisi toteutuessaan mielenkiintoinen.
MITEN USEIN LEGIONELLA-TESTAUSTA TARVITAAN?
Vastaus on kaksiosainen. Sääntely- ja riskiperusteinen. Todellinen testausväli on riskien havainnoinnin ja kustannusten välinen kompromissi, elleivät määräykset edellytä muuta. Sääntelyn osalta asia on yksinkertainen. Testejä on suoritettava niin usein kuin määräykset edellyttävät. Esimerkiksi Yhdistyneessä kuningaskunnassa jäähdytystornit on testattava viljelymenetelmällä kolmen kuukauden välein. Oikeudellinen asiayhteys määräytyy kansallisen työlainsäädännön perusteella, jossa yritys yleensä velvoitetaan suojelemaan henkilöstöään tunnetuilta riskeiltä. Legionella-määräyksissä suojausvelvoite laajennetaan yleensä suureen yleisöön, ja sitä pidetään usein osana yrityksen vastuuta, jolloin päädytään riskiperusteiseen testaamiseen. Riskit ovat laitoskohtaisia (rakennus tai yritys) ja vaihtelevat toimialoittain. Hotellien ja lääketieteellisten tilojen riskit ovat suurempia kuin toimistotilojen, koska niiden on suojeltava mainettaan ja asiakaskunta on alttiimpaa tartunnoille. Vesijärjestelmien fyysiset riskit kasvavat järjestelmän monimutkaisuuden ja iän myötä. Mitä isompi vesijärjestelmä, sitä todennäköisemmin siinä esiintyy kuolleita kulmia – vähän käytettyjä putkistoja – ja vaihtelevia lämpötiloja. Nämä lisäävät legionella-kasvun riskiä. Testausta suositellaan siis sitä useammin, mitä isompi ja vanhempi laitos on kyseessä. Yleispätevän ohjeen antaminen on vaikeaa, joten laitospäälliköt tekevät päätöksensä oman riskinarvionsa perusteella. Kun järjestelmä ei ole vaatimustenmukainen – lämpötilaa ei pidetä 20–50 asteen säätelyalueen ulkopuolella – legionellan kasvu on erittäin nopeaa ja riskit kasvavat eksponentiaalisesti. Hyvin hoidetussa laitoksessa voi olla riittävää testata neljännesvuosittain tai vuosittain, mutta vanhemmissa vesijärjestelmissä kuukausittainen testaus saattaa olla tarpeen. Vuodenaikakin vaikuttaa legionella-kasvuun, joten testit ovat vähemmän tarpeellisia talvikuukausina. Tiheämpi testaus on suositeltavaa, kun järjestelmä on palautettava vaatimustenmukaiseksi. Testejä on suoritettava päivittäin ja sitten viikoittain, kunnes järjestelmän todetaan olevan hallinnassa. Hydrosense-testi antaa todisteen hallinnan palauttamisesta, mistä voi olla hyötyä mahdollisissa oikeustapauksissa.
LEGIONELLA-BAKTEERISOLUJEN KVANTIFIOINTI HYDROSENSE-TESTILLÄ
Legionella-kvantifiointi mitataan perinteisesti kaavalla PMY/litra, eli pesäkkeitä muodostavien yksiköiden määrä per litra. Käsite on peräisin mittausmenetelmästä, jossa näytettä viljellään erityisillä Agar-alustoilla ja lasketaan muodostuvat pesäkkeet. Menetelmä ei mittaa elinkelpoisia, mutta viljelyskelvottomia soluja (VBNC). Legionellan tapauksessa tämä on vakava puute, koska legionellan VBNC-vaihe on bakteerien virulentti tautia aiheuttava vaihe, eikä se edes sisälly perusmenetelmään. Lisäksi muiden bakteerilajien kasvamista Agar-alustoilla on vaikea estää, joten viljelytesteissä esiintyy vääriä positiivisia tuloksia. Hydrosense-testi ei mittaa pesäkkeitä muodostavia yksiköitä vaan antigeenivastetta. Antigeenimäärän ja solujen lukumäärän välillä tulee olla suora korrelaatio. Huomaa, että solujen lukumäärä tulee olemaan pesäkkeitä muodostavia yksiköitä suurempi, koska mukana on VBNC-soluja. Laboratoriotutkimuksemme osoittavat suoran suhteen, ts. korkeammat solumäärät antavat vahvemman antigeenivasteen, kuten vahvempi testiviiva osoittaa. Hydrosense-testi mittaa siis myös VBNC-soluja, mikä on parannus laboratoriotestiin verrattuna. Testin lukusovelluksen avulla voidaan mitata antigeenipitoisuus ja siten osoittaa bakteerien määrä. Negatiivinen Hydrosense-testi osoittaa, että legionella-pitoisuus alittaa havaitsemisrajan. Hydrosense-testiviivan tulos 1 (vaaraindeksi 1) on heikoin luettavissa oleva tulos ja ilmaisee solumäärän, joka vastaa käytetyn testityypin havaitsemisrajaa (Limit of detection, LOD). Tämä on vaaraindeksi 1, joka vastaa 100 PMY/litra käytettäessä suodatusvaihetta, tai 100 000 PMY/litra, jos suodatuskonsentraatiovaihetta ei käytetä. Suuremmat vaaraindeksit ovat osoitus suuremmista legionella-solumääristä. Korrelaatio on suunniteltu hyvin lineaariseksi aina vaaraindeksi 10:een saakka. Osoitettu pitoisuus olisi silloin kymmenkertainen havaitsemisrajaan nähden (LOD). Tätä korkeammat tulokset palautetaan vaaraindeksinä 10. Vaste ulottuu vaaraindeksiin 10, joten kaikki yli 10 kertaa havaitsemisrajan ylittävät pitoisuudet palauttavat vaaraindeksin 10.